Sistema de expresión de proteínas a partir de productos de PCR sin necesidad de clonación previa en vectores de expresión eucariota

Abstract

[ES] El sistema de expresión de proteínas consiste en amplificar por PCR un promotor y una secuencia IRES mediante un cebador directo que hibrida con el extremo 5’ del promotor de la ARN T7 polimerasa y un cebador inverso que hibrida con la secuencia IRES en el extremo 3’. Posteriormente, se amplifica por PCR la secuencia del gen específico (gen de la luciferasa, gen TAT y gen β-Galactosidasa), utilizando un cebador directo, donde el extremo 5’ es complementario a la secuencia IRES y el extremo 3’ de dicho cebador hibrida con el extremo 5’ del gen y un cebador reverso que hibrida con el extremo 3’ del gen que será amplificado. Por último, se realiza una PCR de ensamblaje, donde ambos productos de PCR se amplifican mediante otra PCR, utilizando un cebador directo, el cual hibrida con el extremo 5’ del promotor de la ARN T7 polimerasa y un cebador reverso que hibrida en el extremo 5’ con una cola de poli (A) y en la zona 3’ hibrida con el extremo 3’ del gen específico. Una vez obtenido el ADN recombinante, dicho ADN se transfecta en células de expresión eucariotas sin necesidad de clonación, con el objetivo de cuantificar la expresión del gen marcador basado en la adición de la T7 polimerasa con IRES.

[EN] The protein expression system consist to PCR amplify a promoter and an IRES sequence using a forward primer that hybridizes with the 5' extreme promoter of the T7 RNA polymerase and a reverse primer that hybridizes to the IRES sequence in the 3' extreme. Subsequently, PCR amplified sequence specific gene (luciferase gene, TAT gene and β-Galactosidase gene) using a forward primer, where the 5' extreme is complementary to the IRES sequence and the 3' extreme of the primer hybridizes to the 5' extreme of the gene and reverse primer hybridizes with the 3' extreme of the gene that we amplified. Finally, assembly PCR is carried out, where both PCR products are amplified by another PCR using a forward primer, which anneals to the 5' extreme of the promoter of T7 RNA polymerase and a reverse primer that anneals to the 5' extreme with a tail of poly (A) and the 3' hybridizes to the 3' extreme of the specific gene. Once obtained recombinant DNA, this DNA is transfected into eukaryotic expression cells without cloning, in order to quantify the expression of the marker gene based on the addition of the T7 polymerase with IRES.