Examinando por Autor "Donaire-Rivera, Lourdes"
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Ítem Sistema de expresión de proteínas a partir de productos de PCR sin necesidad de clonación previa en vectores de expresión eucariota(Jaén: Universidad de Jaén, 2016-03-04) Donaire-Rivera, Lourdes; Caruz-Arcos, Antonio-José; Universidad de Jaén. Biología Experimental[ES] El sistema de expresión de proteínas consiste en amplificar por PCR un promotor y una secuencia IRES mediante un cebador directo que hibrida con el extremo 5’ del promotor de la ARN T7 polimerasa y un cebador inverso que hibrida con la secuencia IRES en el extremo 3’. Posteriormente, se amplifica por PCR la secuencia del gen específico (gen de la luciferasa, gen TAT y gen β-Galactosidasa), utilizando un cebador directo, donde el extremo 5’ es complementario a la secuencia IRES y el extremo 3’ de dicho cebador hibrida con el extremo 5’ del gen y un cebador reverso que hibrida con el extremo 3’ del gen que será amplificado. Por último, se realiza una PCR de ensamblaje, donde ambos productos de PCR se amplifican mediante otra PCR, utilizando un cebador directo, el cual hibrida con el extremo 5’ del promotor de la ARN T7 polimerasa y un cebador reverso que hibrida en el extremo 5’ con una cola de poli (A) y en la zona 3’ hibrida con el extremo 3’ del gen específico. Una vez obtenido el ADN recombinante, dicho ADN se transfecta en células de expresión eucariotas sin necesidad de clonación, con el objetivo de cuantificar la expresión del gen marcador basado en la adición de la T7 polimerasa con IRES.